IDT NGS二代測序文庫均一化試劑盒

--獲得高度穩(wěn)定且均一化處理的DNA/RNA測序文庫

北京云肽生物科技代理的美國進(jìn)口IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒，采用了一種新型酶促文庫均一化處理技術(shù)，可對|||umina測序儀測序前的DNA或RNA文庫進(jìn)行均一化處理。通過IDT文庫均一化試劑盒，上機(jī)前無需進(jìn)行單個文庫濃度檢測，可得到優(yōu)化的簇密度和更均衡的文庫。IDT文庫均一化處理試劑盒可搭配常規(guī)建庫實(shí)驗(yàn)流程，不僅能縮短實(shí)驗(yàn)整體的操作時間，還能提高NGS文庫上機(jī)濃度的精確性，實(shí)現(xiàn)混合文庫間測序數(shù)據(jù)量的均一性。IDT文庫均一化處理實(shí)驗(yàn)流程包括文庫的非偏好件選擇、酶均一化反應(yīng)，在文庫擴(kuò)增中使用帶有Normalase標(biāo)記的引物，可穩(wěn)定得到3倍于目標(biāo)均一化濃度的產(chǎn)量。例如上機(jī)前文庫濃度需要均一化為2nM或4nM的標(biāo)準(zhǔn)文庫產(chǎn)量，則IDT均一化反應(yīng)前文庫濃度至少分別為6nM或12M(20ul體積)。該實(shí)驗(yàn)過程中不需要增加額外PCR步驟，僅需將常規(guī)文庫擴(kuò)增引物替換成帶有Normalase標(biāo)記的測序通用引物或帶有樣本標(biāo)簽的引物。IDTxGen Normalase 文庫均一化試劑盒為高通量實(shí)驗(yàn)室提供了快速、可擴(kuò)展的文庫標(biāo)準(zhǔn)化工作流程。

優(yōu)勢

①節(jié)省時間，提高通量：統(tǒng)一的樣本處理過程，生成平衡均一的混合文庫；

②減少文庫測序差異，降低測序費(fèi)用：得到更平衡的混合文庫，允許更多的樣本混合上機(jī)，降低測序成本；

③適用多種工作流程，設(shè)計(jì)靈活：兼容多種文庫制備方法，獲得均一平衡的測序數(shù)據(jù)。

圖.IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒的工作流程始于建庫接頭連接反應(yīng)后，工作流程根據(jù)使用全長或短接頭而不同。通過NormalasePCR，將文庫擴(kuò)增到均一化處理反應(yīng)所需zui低數(shù)量，然后進(jìn)行下游的酶均一化處理。在此過程中，如連按反應(yīng)中使用全長接頭，PCR擴(kuò)增需使用帶有Nomalase標(biāo)記的測序通用引物;如使用非全長接頭，則需使用帶有Normalase標(biāo)記的樣本標(biāo)簽作為擴(kuò)增引物。將擴(kuò)增好的單個NGS文庫分別進(jìn)行15分鐘Normalasel孵育，此反應(yīng)過程使用酶促法，可以無偏好性地選擇指定摩爾濃度的NGS文庫。之后，將每個文庫等體積的混合到一管中，進(jìn)行15分鐘Normalase ll孵育，酶促法將每個NGS文庫標(biāo)準(zhǔn)化到指定的摩爾濃度。實(shí)現(xiàn)上機(jī)測序前，得到平衡且均一化的NGS混合文庫。

一

表.使用lDT Normalase試劑盒將文庫均一化處理成4nM，上樣濃度為12pM，得到和預(yù)期一致的簇密度(lllumina MiSeq測序，V2版本試劑)。

二、相比傳統(tǒng)上機(jī)定量方式，可得到數(shù)據(jù)量更均一的混合文庫

圖、測試分別來自于兩名實(shí)驗(yàn)者(n=16/每名實(shí)驗(yàn)者)的32個樣品，使用IDT xGen DNA Library PrepEZ 試劑盒構(gòu)建文庫。實(shí)驗(yàn)樣本為NA12878 gDNA，起始量為1~250ng。NormalasePCR后的文庫使用qPCR方法定量，保證文庫達(dá)到Normalase反應(yīng)所需zui低閾值。"qPCR":基于qPCR定量結(jié)果，對文庫進(jìn)行均一化處理、混樣和測序;"Normalase":同樣樣品使用Normalase試劑盒，對文庫進(jìn)行混樣、均一化處理和測序。比較兩種方法每種接頭測序產(chǎn)生數(shù)據(jù)百分比(lllumina Miseq v2的50循環(huán)測序試劑盒)。結(jié)果顯示:qPCR混含文庫中文庫測序數(shù)量變異系數(shù)(CV)為22.5%，而Normalase混合文庫池的變異系數(shù)為9.4%(中位線為95%的置信區(qū)間)。

圖.10ngNA12878 gDNA，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ試劑盒構(gòu)建96個文庫，搭配IDT xGen CDl接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增。文庫混樣、均一化處理前，使用Qubit定量結(jié)果做等體積的文庫混樣，之后使用lllumina Miseq V2測序試劑盒上機(jī)測序(50個循環(huán))，通過每種接頭產(chǎn)生測序數(shù)據(jù)量百分比進(jìn)行比較。均一化反應(yīng)之前混合文庫池CV為15.5%，證明Normalase引物的擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好。將相同的文庫均一化處理到4nM，并使用lllumina Miseq V250循環(huán)測序試劑盒上機(jī)測序。均一化處理后，文庫CV降為7.7%，證明通過IDT xGen Normalase可得到更加均一化的混合文庫(中位線為95%置信區(qū)間)。

圖.針對不同GC%含量基因組細(xì)菌的測序覆蓋度及冗余率結(jié)果

使用IDT xGen DNALibrary Prep EZ建庫試劑盒，起始量為100ng DNA，包含三種不同比例混合的參考菌株(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈酶球菌)。片段化DNA至350bp，建庫時搭配全長的Y型接頭進(jìn)行連接，使用Normalase標(biāo)記的通用測序引物擴(kuò)增3、5或7個循環(huán)。依據(jù)qPCR定量結(jié)果進(jìn)行文庫混合，并使用lllumina MiSeq PE150測序。測序結(jié)果顯示，不同GC%含量基因組細(xì)菌的測序覆蓋度及冗余率沒有顯著差異。

圖.使用IDT文庫均一化試劑盒，對插入片段大小即菌種覆蓋度評估無影響

將5ng的MSA-1000樣品(GC%基因組含量不同的10種等比例混合菌株)，用IDT xGen DNA Lilbrary PrepEZ 試劑盒構(gòu)建文庫，分別用IDT Normalase標(biāo)記引物(紫紅色)和IDT普通引物(藍(lán)色)對兩個文庫進(jìn)行擴(kuò)增。使用IDT均一化試劑盒或Qubit將文庫均一化處理為4nM。進(jìn)行l(wèi)llumina MiniSeq 平臺高通量上機(jī)(PE-150)測序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的基因組文庫中(由不同GC%含量的細(xì)菌組成)，經(jīng)IDT均一化處理的文庫，仍保持養(yǎng)穩(wěn)定插入片段大小(A)和高基因組覆蓋度(B)。

三、文庫均一化試劑盒的使用，不影響原有RNA測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果

平行對比RNA文庫進(jìn)行上機(jī)前均一化處理使用IDT文庫均一化試劑盒(n=2)、GPCR方法(n=2)的效果。4個RNA-seq文庫(50ng人腦mRNA樣本)分別使用帶有Normalase標(biāo)記的雙端樣本標(biāo)簽、常規(guī)雙端樣本標(biāo)簽進(jìn)行文庫制備。將帶有常規(guī)樣本標(biāo)簽的文庫(標(biāo)記為"1"和"2"號文庫)，按qPCR定量結(jié)果進(jìn)行文庫均一化及混樣。將帶有Nomalase標(biāo)記的文庫(標(biāo)記為"3"和“4號文庫)，在文庫制備完成后，搭配IDT文庫均一化試劑盒，將RNA文庫均一化處理至4nM，通過Miniseq(2x150)上機(jī)測序，證明IDT文庫均一化試劑盒對RNA-Seq分析結(jié)果無影響。將各文庫均一化處理至4nM后上機(jī)測序，使用STAR、Picard及RSeQC進(jìn)行比對、進(jìn)行RNA·sec數(shù)據(jù)分析。韋恩圖結(jié)果顯示，每個樣本中檢測到的qian一千個轉(zhuǎn)錄本結(jié)果沒有顯著差異。

表.相同RNA文庫，分別使用qPCR文庫定量、IDT Normalase文庫均一化試劑盒進(jìn)行文庫均一化處理，其RNA·seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進(jìn)行文庫均一化處理，因而兩種文庫均一化處理有著近似的RNA-seq分析結(jié)果，與預(yù)期相符。

表.相同RNA文庫，分別使用qPCR文庫定量、IDT Normalase文庫均一化試劑盒進(jìn)行文庫均一化處理，其1000個高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本分析結(jié)果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進(jìn)行文庫均一化處理，因而二者的1000個高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本RNA-seq分析結(jié)果近似，與預(yù)期相符。

圖.韋恩圖顯示每個樣本中檢測到的qian一千個轉(zhuǎn)錄本結(jié)果沒有顯著差異

IDT文庫均一化試劑盒優(yōu)勢

①可靈活調(diào)整均一化處理后文庫濃度，只需樣本擴(kuò)增后濃度超過最少文庫量閾值，即可保證最終所需文庫濃度均一化;

②處理后的均一化文庫濃度為4nM，選擇使用≥6nM均一化工作流程時，最終文庫濃度為2nM;

③混合文庫間測序變異系數(shù)系數(shù)≤10%;

④試劑盒兼容性強(qiáng)，可兼容全長測序接頭或短接頭的建庫流程;兼容非靶向富集的工作流程，制備的文庫可直接測序(如全基因組測序或全轉(zhuǎn)錄組測序);兼容雜交捕獲流程，即靶向富集完成后上機(jī)前的文庫均一化。需保證均一化反應(yīng)前，有穩(wěn)定的文庫產(chǎn)量(20μL反應(yīng)體系中文庫摩爾濃度≥6nM或≥12nM)，以得到標(biāo)準(zhǔn)的2nM/4nM文庫量;

⑤兼容IDT xGen接頭、IDT xGen Normalase CDl引物、IDT xGen Normalase UDl引物;

⑥兼容IIlumina測序平臺，并可獲得一致的測序結(jié)果。

北京云肽生物科技代理的IDT文庫均一化試劑盒產(chǎn)品